綠色熒光蛋白的基因克隆和表達(dá)的研究

引言

    隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用, 人們根據(jù)自己的意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見地將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi), 使外源基因進(jìn)行表達(dá)、闡明基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理或者通過與染色體基因組進(jìn)行穩(wěn)定整合，將生物性狀傳遞給子代動(dòng)物的研究方興未艾^[1]。 　
    基因標(biāo)記技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)。熒光蛋白基因在標(biāo)記基因方面由于具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已被普遍應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個(gè)方面。熒光蛋白是海洋生物體內(nèi)的一類發(fā)光蛋白，分為綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白^[2]。 
     2008 年10 月8 日，瑞典**科學(xué)院把今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者和推廣者。他們分別為日本科學(xué)家下村修(Osamu Shimomura)、美G科學(xué)家馬丁·查爾菲(Martin Chalfie)和錢永健(Roger Tsien)^[3]。1962 年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974 年，他們分離得到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白(GFP)^[4] 。1994 年，查爾菲等**在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)了能發(fā)射綠色熒光的GFP，開創(chuàng)了GFP 研究與應(yīng)用之先河^[5]?！? 
    綠色熒光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238 個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，其分子量為27 kDa。GFP 作為一種新的報(bào)告基因，與以往lacZ、CAT 等報(bào)告基因相比，有很多無(wú)可比擬的優(yōu)越性: GFP 不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光,尤其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；另外GFP 分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無(wú)毒害,安全可靠；并且通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。正是由于GFP 檢測(cè)具有高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需使用同位素等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究*域^{[ 6～7]} 。采用GFP 作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有效的手段^{[ 8、9 ]} 。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP 標(biāo)記的方法，可建立一種簡(jiǎn)便、快速的免疫診斷技術(shù)^[10] 。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞是分子克隆的關(guān)鍵步驟^[11]，是基因克隆以及DNA文庫(kù)構(gòu)建等研究中頻繁使用的一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。一般實(shí)驗(yàn)室沒有電穿孔技術(shù)所需要的特殊儀器，而利用氯化鈣法將質(zhì)粒重組入大腸桿菌細(xì)胞，操作方便、應(yīng)用廣泛.目前, 感受態(tài)細(xì)胞的制備主要采用CaCl₂ 法， 該方法操作簡(jiǎn)單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高， 可廣泛應(yīng)用于一般的實(shí)驗(yàn)室。其原理是Ca²⁺ 破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無(wú)機(jī)磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA 的滲入^{[12]#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#}。
    PCR 技術(shù)是Kary Mullis 在1985 年建立起來(lái)的在細(xì)胞體外合成DNA 的一種方法。依DNA 半保留復(fù)制原理，利用DNA聚合酶依賴于DNA 模板的特性，在附加的兩個(gè)引物與模板雜交之后，按堿基配對(duì)原則經(jīng)酶促反應(yīng)合成DNA 片段，包括模板變性、引物退火及用DNA聚合酶延伸兩個(gè)引物之間DNA 的一定次數(shù)的重復(fù)循環(huán)，使包括在兩個(gè)引物5'端限定的特異性片段形成指數(shù)式積累。整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，可在短時(shí)間內(nèi)在小管中獲得大量的特意的DNA 拷貝，這一特點(diǎn)使PCR 技術(shù)很快被應(yīng)用到了分子生物研究的廣大*域^[13]。
大腸桿菌是**個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)^[14]。而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚**能超過細(xì)菌中蛋白量的30 %，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用**廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)^[15]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前**常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作,以及有大量可供選擇的克隆或表達(dá)載體,使之成為人們克隆表達(dá)外源基因的主要菌株^[16]。
 隨著人們對(duì)原核和真核生物基因調(diào)控的了解，通過綜合控制基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，構(gòu)建出了多種具有不同特點(diǎn)的表達(dá)載體和工程菌株，以滿足表達(dá)不同性質(zhì)、要求的目的基因的需要。在原核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體常用啟動(dòng)子有T7啟動(dòng)子、Trp啟動(dòng)子-色氨酸啟動(dòng)子、Tac啟動(dòng)子、T7噬菌體中基因10 的啟動(dòng)子及Lac啟動(dòng)子等。Lac啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)活化蛋白和cAMP的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控，當(dāng)加入乳糖或某些類似物IPTG可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使阻遏蛋白構(gòu)型改變，阻遏蛋白不再能與操縱基因結(jié)合，從而使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。根據(jù)原核生物基因表達(dá)特點(diǎn)選著載體進(jìn)行目的基因克隆，然后轉(zhuǎn)入相應(yīng)的菌種中表達(dá)目的蛋白質(zhì)^[17]。
 研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和表達(dá)。通過質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，通過酶切、PCR及用IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達(dá)。
 

1 材料與方法

1.1  材料

1.1.1  實(shí)驗(yàn)材料

克隆菌E.coli DH-**、表達(dá)菌BL-21為本實(shí)驗(yàn)室收藏菌種，質(zhì)粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性內(nèi)切酶 Bam H1、 Not Ⅰ購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2  儀器設(shè)備

SIM-f140 SANYO Ice Maker(made in Japan)
Eppendof離心機(jī)5430R（Made in Germany）
電泳儀 （DYY-12型，北京市六一儀器廠）
電子天平 （AB204-N 型，Mettler-Toleda Group）
臺(tái)式離心機(jī) （TGL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）
控溫磁力攪拌器 （HJ-3型，江蘇金壇市金南儀器廠）
調(diào)溫電熱套 （KDM型，武漢精華科教儀器有限公司）
ph計(jì)（雷磁PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）
冰箱 （BCD-208K/A NCJN型，青島海爾股份有限公司）
臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器 （THZ-C-1型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）
手提紫外燈（WD-9403E型，北京市豐臺(tái)區(qū)造甲街128號(hào)）
生物潔凈工作臺(tái) （BCM-1000型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）
電熱恒溫水溫箱（SHW 21-420型，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）
 
瓊脂糖凝膠電泳電泳裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)、酒精燈、培養(yǎng)皿、
移液槍、槍頭 、接種環(huán) 、酒精棉球 、滅菌槍頭 、Parafilm膜、離心管 

1.1.3  試劑及溶液 

50×TAE電泳緩沖母液（50 mL）
Tris-堿	12.1 g
冰醋酸	2.85 mL
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)	5 ml

             

6×DNA電泳緩沖液
溴酚藍(lán)	0.25 %
蔗糖水溶液	40%（W/V）

                

液體LB培養(yǎng)基（pH7.0）
胰蛋白胨	10 g/L
酵母提取物	5 g/L
NaCl	10 g/L
NaOH(1 mol/L)	1 mL/L

 分裝后于121 ℃ 高壓滅菌20 min。（LB固體培養(yǎng)基是在液體LB中加瓊脂粉**1 %）；#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

溶液Ⅰ  50 mL
葡萄糖	50 mmol/L
Tris-Cl (pH 8.0)	25 mmol/L
EDTA (pH 8.0)	10 mmol/L

121℃高壓滅菌 15 min后置于0~4℃貯存；

溶液Ⅱ  100 mL
NaOH	0.2 mol/L
SDS	1% (W/V)

用時(shí)由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀釋現(xiàn)配；

溶液Ⅲ  100 mL
KOAc (5 mol/L)	60 mL
冰乙酸	11.5 mL
H2O	28.5 mL

 121 ℃高壓滅菌 15 min后置于0~4 ℃貯存；
氯仿；
瓊脂糖；
滅菌的去離子水；
10×酶切緩沖液；
TaqDNA聚合酶；
TaqDNA聚合酶緩沖液；
滅菌的0.1 mol/L CaCl₂
標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量的DNA；
溴乙錠（EB）儲(chǔ)存液  0.5 µg/mL；
LB/Kan（50 µg/mL）固體培養(yǎng)基；
IPTG配成濃度為400 mM水溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?br /> 卡那霉素（Kan）配成濃度為100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?br /> 70%乙醇：用新開裝的乙醇和滅菌無(wú)離子水配成，放在0~4 ℃；
無(wú)水乙醇（分析純，武漢市中天化工有限公司）放在0~4 ℃；
RNase 母液：將RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)、15 mmol/L  NaCl 配成的試劑中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加熱15 min，使可能溶有的DNase失活，然后緩慢冷卻**室溫，分裝成小份保存于－20 ℃；

1.2  方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1重組質(zhì)粒pET-28a-GFP的構(gòu)建流程
Fig.1  The formed technological process of pET-28a-GFP recombined plasmid

1.2.2 DH-5α 和BL-21感受態(tài)細(xì)胞的制備

1) 將0~4 ℃保存的DH-5α 和BL-21菌種分別接種在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃下250 r/min過夜培養(yǎng)16 h 。
2) 將分別接種過夜菌：LB按1:50的比例接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)2～3 h**OD=0.3～0.5 。
3) 取1.5 mL菌液轉(zhuǎn)入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min離心5 min。棄上清液，沉淀加入0.1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl₂緩和懸菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min離心10 min。
4) 棄上清液，沉淀用0.1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl₂（含15%甘油）緩和懸菌，放在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

1)  取制備好的感受態(tài)細(xì)胞100 μl，冰上解凍，均勻懸浮。
2)  加入2 μl酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min。
3)  42 ℃水浴中熱擊70 sec后，冰上放置2 min。
4)  加入200 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，50-100 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。
5)  取200 μl懸浮細(xì)胞涂布在含合適抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培養(yǎng)倒置12-16 h。

1.2.4 堿法提質(zhì)粒

1)  感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，平皿內(nèi)有但菌落長(zhǎng)出。
2)  用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒于2 mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃, 180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。
3)  取1.5 ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 r/min 離心1分鐘，吸棄上清。
4)  向離心管中加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重懸沉淀。
5)  加入200 ml新配制的溶液 Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘。
6)  加入150 ml用冰預(yù)冷的溶液 Ⅲ，輕輕混勻，冰上放置3~5分鐘。
7)  用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。
8)  加等體積氯仿400 ml抽提，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
9)  吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，于室溫放置2分鐘；用微量離心機(jī)于4 ℃、11000 rpm離心5分鐘，棄上清。
10)  用70%乙醇洗滌2次，再次4 ℃、11000 rpm離心5分鐘，沉淀于空氣中干燥。向已干燥的離心管內(nèi)加20 ml超純水溶解質(zhì)粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 ℃處理1小時(shí)后于-20 ℃貯存。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

1.2.5 酶切鑒定

1)  取提取的質(zhì)粒8 ml于另一微量離心管中，加入2 ml Bam H I和Not I的酶切混合液，輕彈管外混勻反應(yīng)物。
2)  離心，使溶液聚集在管底部。
3)  37 ℃，酶切反應(yīng)。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳

1)  稱取0.8 g瓊脂糖，放入到錐形瓶中，加入100 mL 1×TAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱**完全融化，冷卻**60 ℃左右。
2)  輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上。
3)  將膠板除去封膠帶，加電泳緩沖液**電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米，輕輕拔除梳子。
4)  吸取10 ml的質(zhì)粒與2 ml的上樣液混勻，吸取混合液將加入加樣孔。
5)  接通電泳槽與電泳儀的電源，設(shè)置電泳數(shù)據(jù)U=100 V,  I=30 mA。
6)  當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2 cm處，停止電泳。
7)  在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.7 PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1)  將PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反應(yīng)體系各成分

PCR反應(yīng)體系	各成分的量
template	0.1 ml
P1(20 mM)	0.2 ml
P2(20 mM)	0.2 ml
dNTPs(10 mM)	0.4 ml
Taqs(5 U/ml)	0.2 ml
10×PCR buffer	2 ml
ddH2O	16.9 ml
Total	20 ml

2)  將PCR管放入PCR儀中，設(shè)定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s，退火60-55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃。變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 2 min。
3)  PCR擴(kuò)增完畢后，取出PCP管放在冰盒上。
4)  取8 ml擴(kuò)增后產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.8 pET-28a-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL-21

1)  取100 μl感受態(tài)BL-21，冰上慢速解凍，均勻懸浮。加入2 μl經(jīng)過酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min。
2)  42℃水浴熱激70 s，冰上放置2 min。
3)  加入200 μl 含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，60 r/min震蕩培養(yǎng)30 min。四支EP管中加入0.5 μl 的100 mM的IPTG誘導(dǎo)，另外EP管中不加入IPTG誘導(dǎo)。
4)  吸取200 μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 ℃培養(yǎng)倒置12-16 h。

1.2.9 重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)表達(dá)

1)  取GFP重組菌接種于2 ml LB培養(yǎng)液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃ 150-220 r/min過夜培養(yǎng)。
2)  將20 μl菌液按1：50—100接種于2 ml LB培養(yǎng)液(含Kana 100 mg/l)中，37 ℃ 200r/min培養(yǎng)2h。
3） 按IPTG: LB培養(yǎng)基按1:1000加入2 μl的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組不加IPTG誘導(dǎo)。
4） 用紫外線照射菌體沉淀，保存照片。
 
 
 

2  結(jié)果與分析

2.1  提取質(zhì)粒

                
                    圖1 提取質(zhì)粒時(shí)加入各溶液的現(xiàn)象
A. 加入溶液1渾濁；B. 加入溶液2變澄清；C. 加入溶液3出現(xiàn)白色絮狀沉淀；D. 加入氯仿抽提溶液分層

2.2  重組質(zhì)粒構(gòu)建的鑒定

                          
                 圖2 酶切重組質(zhì)粒pET-28a-GFP
        Fig.2  indentification of pET-28a-GFP plasmid cleavage
Lane1：Marker protein；Lane 2：含目的基因的重組質(zhì)粒，得到有兩條帶，可知前面**條帶為GFP基因片段，第二條帶為質(zhì)粒載體，故成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-GFP。

2.3  PCR檢測(cè)結(jié)果 

 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
                   圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
            Fig. 3  PCR indentification of pET-28a-GFP
PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測(cè)，可以看到明顯的一條亮帶，其大小約為750 bp?？芍猠GFP基因成功連接到pET-28a載體。其前面不明顯的彌散的條帶為引物二聚體。

2.4  IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 

 
             圖 4 日光燈和紫外燈下的表達(dá)結(jié)果
    在日光燈和紫外光下，攜帶重組質(zhì)粒pET-28a-GFP的大腸桿菌BL-21用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后呈現(xiàn)綠色，說(shuō)明含外源基因GFP的質(zhì)粒在大腸桿菌BL-21體內(nèi)成功表達(dá)；而沒有經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體則不發(fā)出綠色熒光。
 
 
 
 
 
 
 
 

3  討論

本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，與我們平時(shí)的實(shí)驗(yàn)相比對(duì)我們的要求更多更嚴(yán)。它主要要求我們形成認(rèn)真思考的習(xí)慣，自己查閱本實(shí)驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)，分析本實(shí)驗(yàn)的目的，通過本實(shí)驗(yàn)要達(dá)到什么樣的結(jié)果，達(dá)到預(yù)計(jì)的結(jié)果需要通過怎樣的方案實(shí)現(xiàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和自己的相關(guān)了解自己設(shè)置適合的實(shí)驗(yàn)方案，增強(qiáng)我們的思維能力和動(dòng)手能力，同時(shí)也使我們的團(tuán)隊(duì)合作精神得到了提高，并學(xué)會(huì)把我們所學(xué)的知識(shí)有機(jī)的結(jié)合到一起。跟我們平時(shí)的實(shí)驗(yàn)相比較我們的實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)可以得到很大的提高，有利于我們今后的學(xué)習(xí)和研究。通過本次實(shí)驗(yàn)我深刻的認(rèn)識(shí)到了，在我們做研究的過程中一定要認(rèn)真，每一步都不能出錯(cuò)，否則將功虧一簣，從頭開始。
     實(shí)驗(yàn)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli DH 5α中的轉(zhuǎn)化率很低，本組從E.coli DH 5α中提取的質(zhì)粒共9管，酶切發(fā)現(xiàn)有重組質(zhì)粒存在的只有1管，轉(zhuǎn)化率不高。造成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率不高的原因可能有以下幾點(diǎn)：
（1）生長(zhǎng)時(shí)期：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌易生感受態(tài)，轉(zhuǎn)化時(shí)菌濃度應(yīng)控制在不超過107個(gè)/ml。濃度過高或者過低都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。
（2）CaCl₂法0 ℃放置時(shí)間的影響：細(xì)菌經(jīng)0 ℃ CaCl₂處理后轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24 h達(dá)到**高，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降。
（3）化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在鈣離子的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。
（4）質(zhì)粒大小、構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1 ng超螺旋DNA即可使50 ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。
（5）防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在冰浴低溫和無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管、EP管等均應(yīng)徹底洗凈，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其他試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。
（6）試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl₂等均需是**高純度的，并用超純水配制，**好分裝保存于干燥的冷暗處。
（7）42 ℃熱處理時(shí)間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時(shí)注意熱處理過程中離心管不要搖動(dòng)。
（8）菌液涂平皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)胞的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。
在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21 細(xì)胞后,在平皿中用IPTG誘導(dǎo)長(zhǎng)出菌苔，但未出現(xiàn)單菌落，可能的原因有：（1）菌液沒有涂開；（2）涂完后未先正放1h使菌液充分被LB吸收；（3）平皿上有水珠，未除去；（4）搖菌時(shí)間過長(zhǎng)，菌過多。**后經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，本組中未有一管表達(dá)成功，僅有老師的兩管表達(dá)出綠色的熒光蛋白，表達(dá)量很低，可能的原因：（1）在轉(zhuǎn)化過程中，由于操作不當(dāng)，使重組質(zhì)粒本身轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL-21的量很少，故經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)量就很少。（2）pET-28a質(zhì)粒在菌體中的拷貝數(shù)本來(lái)就很低，和其他質(zhì)粒相比量會(huì)少一些，可以多搖一段時(shí)間，16-18h都可以，略微提高抗生素的濃度，有助于提高拷貝數(shù)，加入IPTG后，有助于提高表達(dá)量。（3）由于表達(dá)菌株BL-21沒有end-A突變，質(zhì)粒的完整性和保真性都不如DH5α，因?yàn)榱呀鈺r(shí)會(huì)有大量多糖干擾，質(zhì)和量都不如DH5α，pET質(zhì)粒拷貝數(shù)很低，故重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21的效率相對(duì)較低；DH5α是重組酶缺陷型，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，而BL-21為非重組酶缺陷型，轉(zhuǎn)化進(jìn)入其中的重組質(zhì)粒不能穩(wěn)定存在，故GFP誘導(dǎo)表達(dá)量就相對(duì)較低。